朱菡1，王夢1，趙成軍，李若松，楊娟1，裴廣暢1，葉婷2，左學(xué)志2，劉柳1，Octavia LS Chong Lee Shin1，朱鳳鳴1，孫潔2，徐虎子1，趙志1，曹楚瑾1，王玉璽1，楊倩1，徐鋼1，曾銳1，姚穎1,2

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 同濟(jì)醫(yī)院 1腎臟科、2營養(yǎng)科，中國，湖北，武漢，解放大道1095；

3武漢和格生物技術(shù)有限公司，中國，湖北，漢陽大道630號

收到 2018.01.20  接收 2018.04.06  電子版 2018.06.15  刊出 2018.06.30

摘要：粘多糖（GAG），作為II型膠原蛋白的組成部分，其與骨代謝有著相對緊密的關(guān)系。事實(shí)證明，復(fù)合骨膠原能促進(jìn)骨小梁結(jié)構(gòu)的連接。然而，確切的機(jī)制尚不清楚。在本文中，我們旨在確定復(fù)合骨膠原對糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松的具體影響和機(jī)制。在60天內(nèi)，每天用GAG灌胃。結(jié)果表明，復(fù)合骨膠原對糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松癥具有保護(hù)作用。在使用復(fù)合骨膠原治療后，小梁的數(shù)量和連接密度增加。我們生成了骨髓來源的巨噬細(xì)胞，以探索復(fù)合骨膠原對破骨細(xì)胞分化的影響。我們收集了存在于巨噬細(xì)胞群刺激因子（M-CSF）和核因子-kB配體受體激動劑（RANKL）中的細(xì)胞蛋白和RNA，發(fā)現(xiàn)了復(fù)合骨膠原抑制了NF-kB和MAPK通路，從而下調(diào)破骨細(xì)胞分化分子，例如：基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP 9）和活化T細(xì)胞、胞質(zhì)1的核因子（NFATc-1）。我們的研究結(jié)果表明，復(fù)合骨膠原在臨床環(huán)境中可能具有治療糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥的治療潛力。

關(guān)鍵詞：糖皮質(zhì)激素，骨質(zhì)疏松癥，復(fù)合骨膠原，NF-kB和MAPK通路

簡介

慢性腎臟疾病（CKD）的特點(diǎn)是腎結(jié)構(gòu)和各種原因引起的功能在幾個月或幾年的時間里逐步喪失，通常大于3個月。中國的一個現(xiàn)況研究顯示，10.8%的中國人患有CKD；即，中國的CKD患者數(shù)量估計(jì)大約為1億1950萬人。糖皮質(zhì)激素（GCs）由于其高抗炎和免疫抑制作用，是CKD患者中最常用的藥物之一。然而，長期和高劑量的使用可以使患者重新出現(xiàn)大量的不良并發(fā)癥包括糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松癥（GIOP）。

GIOP是最常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，其特點(diǎn)是骨質(zhì)疏松、骨強(qiáng)度降低，骨折風(fēng)險增加。GCs的內(nèi)源性和生理濃度對成骨細(xì)胞的分化和激活起到了積極的作用，促進(jìn)了生理骨形成過程。相反，接受GCs藥物治療的患者則會經(jīng)歷一種非常繁瑣的體驗(yàn)。一些對GC敏感的患者在長期和高劑量的GC治療后甚至不能正常行走或站立，因此他們的生活質(zhì)量很低。研究表明，GCs破壞了成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活動的平衡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞數(shù)量和活動的減少或破骨細(xì)胞數(shù)量和活動的增加改變了骨形成和骨吸收之間的平衡，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。

NF-kB通道和它的下游分子，例如MMP 9，CTSK和NFATc-1，被認(rèn)為是與GIOP密切相關(guān)的關(guān)鍵監(jiān)管機(jī)構(gòu)。這些下游分子的過表達(dá)促進(jìn)骨髓巨噬細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。

II型膠原蛋白是一種主要表現(xiàn)在皮膚和骨骼中的蛋白質(zhì)。膠原纖維，彈性蛋白和粘多糖（GAG），這些成分相互交織形成一個與骨密度相關(guān)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而增加骨的質(zhì)量和強(qiáng)度。特別是GAG，被用作是測量II型膠原蛋白和骨代謝的重要標(biāo)志。然而，相關(guān)機(jī)制尚不清楚。

在這項(xiàng)研究中，我們旨在確定在破骨細(xì)胞生成過程中，復(fù)合骨膠原對骨骼過程的影響。復(fù)合骨膠原抑制了GC引起的骨質(zhì)疏松癥，該骨質(zhì)疏松癥是通過NF-kB和MAPK通道促進(jìn)破骨細(xì)胞相關(guān)分子MMP 9、CTSK和NFATc-1，導(dǎo)致的破骨細(xì)胞分化。復(fù)合骨膠原抑制GCs-介導(dǎo)破骨細(xì)胞生成，通過這種方式抑制了GC誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥。

原料和方法

制備純復(fù)合骨膠原溶液

通過復(fù)合骨膠原片劑（武漢和格生物技術(shù)有限公司）制備復(fù)合骨膠原溶液。片劑溶解于蒸餾水中濃度為10%（10g/100ml）；PH值調(diào)制7.0。最后，該溶液通過防細(xì)菌過濾器過濾，以保持無菌。

動物和處理

雄性C57bl/6小鼠（8周大，重25g）是從北京華富康實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司（北京，中國）購買的。在同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物護(hù)理病房，動物們適應(yīng)了特定的無病原體（SPF）條件下的居住環(huán)境。動物被保存在22攝氏度的溫度環(huán)境中，有12 h/12 h的光/暗周期，持續(xù)10周，直到4.5個月大。從美國的Innovative Research（IRA，佛羅里達(dá)，美國）購買了安慰劑和氫化潑尼松緩釋球團(tuán)。動物被隨機(jī)分為四個實(shí)驗(yàn)組：正常組（沒有特殊的干預(yù)），安慰劑組（給小鼠皮下植入7.5mg的安慰劑，60天緩釋），氫化潑尼松組（給小鼠皮下植入7.5mg的氫化潑尼松，60天緩釋），GAG組（給小鼠皮下植入同等劑量的氫化潑尼松緩釋團(tuán)，同時給其灌胃復(fù)合骨膠原溶液）；每組6-8只小鼠。我們選擇的是總劑量為7.5mg，釋放期為60天的球團(tuán)做研究。通過注射1%的戊巴比妥鈉（0.008ml/每克身體重量）使小鼠麻醉。然后，在肩胛骨上方創(chuàng)建合適的地方來植入緩慢釋放安慰劑和氫化潑尼松的球團(tuán)。手術(shù)后，復(fù)合骨膠原溶液的劑量為每克身體重量0.45mg/day。60天后，頸椎脫位處死小鼠。我們在60天后沒有發(fā)現(xiàn)任何的球團(tuán)。手機(jī)股骨、脛骨和血液做進(jìn)一步分析。所有的實(shí)驗(yàn)程序都是按照國家衛(wèi)生研究院的指導(dǎo)方針進(jìn)行的，并得到同濟(jì)醫(yī)院動物保護(hù)和使用委員會（ACUC）的批準(zhǔn)。

骨形態(tài)參數(shù)

通過顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描（μ-CT50，Scanco醫(yī)療，巴瑟爾斯多夫，瑞士）分析了左脛骨的骨形態(tài)參數(shù)和顯微結(jié)構(gòu)特征。脛骨近端采用內(nèi)置軟件進(jìn)行三維重建，小梁參數(shù)包含骨體積/總體積比（BV/TV），小梁數(shù)量（Tb.N），小梁厚度（Tb.Th），小梁空間（Tb.Sp），骨面積/骨體積比（BS/BV），以及連通性密度（Conn.D）。

病態(tài)骨著色

將股骨固定于4%多聚甲醛溶液中2天。然后在0.5 M ETDA（PH=8.0）溶液中進(jìn)行3周的脫鈣處理并嵌入進(jìn)石蠟中。石蠟嵌入的股骨被分成5μm個部分，用伊紅（H&E）著色，并在顯微鏡（奧林巴斯，日本）下觀察。

免疫印跡分析

在液氮中粉碎骨組織，并在含有蛋白酶抑制劑混合物（促進(jìn)劑，武漢，中國）和苯甲基磺酰氟（促進(jìn)劑，武漢，中國）的RIPA裂解緩沖液（促進(jìn)劑，武漢，中國）中均質(zhì)化。以同樣的方式收集細(xì)胞蛋白。按照制造商的指示用BCA試劑盒測定總蛋白的濃度(促進(jìn)劑，武漢，中國)。蛋白質(zhì)被SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜（密理博，比勒利卡，MA, 美國）。這些膜在0.1%至20的TBS中被5%的脫脂牛奶阻斷1小時，37℃。然后對OPG抗體進(jìn)行探測（稀釋1:1000，Bioworld, 中國），RANKL（稀釋1:1000，ProSci Inc., 美國），MMP 9（稀釋1:1000，Abcam, 英國），NFATc-1（稀釋1:1000，Abcam, 英國），CTSK（稀釋1:1000; Abcam,英國），總磷-65，-38，-ERK，-JNK（稀釋1:1000，細(xì)胞信號技術(shù)，美國）和GAPDH（稀釋1:4000, Abbkine, 中國）在4攝氏度下持續(xù)一整晚。第二天印跡被洗掉，在37℃下用共軛HRP二級抗體培育1小時，通過化合光可視化增強(qiáng)（ECL, BioRad, 美國）。使用ImageJ分析目標(biāo)帶的灰值（NIH, 美國）。

細(xì)胞培養(yǎng)

從4周齡的雄性C57bl/6小鼠中分離得到原發(fā)性骨髓單核細(xì)胞。用培養(yǎng)液沖洗股骨和脛骨，然后采集骨髓細(xì)胞到直徑10厘米的盤中。在含10%胎牛血清的α-MEM媒介中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)（FBS），100 U /mL青霉素，100 U /mL鏈霉素和30 ng/mL的巨噬細(xì)胞集落刺激因子M-CSF（PeproTech，Rocky Hill，新澤西）。24小時后，在M-CSF存在下收集漂浮細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)3天。粘附細(xì)胞作為骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMMs）以待進(jìn)一步使用。BMMs保持在潮濕的培養(yǎng)器中（熱科學(xué)，美國），37℃，5% CO2，95%大氣。培養(yǎng)液每兩天補(bǔ)充一次。

細(xì)胞活性測量

細(xì)胞計(jì)數(shù)kit-8（促進(jìn)劑，武漢，中國）被用來評估細(xì)胞活性。把BMMs培養(yǎng)在密度為5 × 103的96格孔板中的每格孔板中。在細(xì)胞粘附后，用不同濃度的復(fù)合骨膠原(GAG: 0, 0.0015, 0.0075, 0.015,0.15, 1.5 g/L)和地塞米松(DXM: 0,0.001, 0.01, 0.1, 1 μM)治療細(xì)胞96小時。然后用10% CCK-8的完全培養(yǎng)液代替細(xì)胞培養(yǎng)液。在37℃下孵化1-4小時，用多模式讀取器測量450nm處的吸光度。

TRAP著色

為了檢測破骨細(xì)胞的分化，BMMs暴露于100 ng/mL的RANKL（PeproTech，Rocky Hill，新澤西）和30 ng/mL的M-CSF。用不同濃度的復(fù)合骨膠原(0,0.0015, 0.0075, 0.015, 0.15, 1.5 g/L) 和地塞米松(0.1 μM) 對細(xì)胞進(jìn)行治療96小時，然后根據(jù)制造商的指示用4%多聚甲醛固定，并用抗酒石酸性磷酸酶著色（TRAP）。（酸性磷酸酶，白細(xì)胞（TRAP）Kit, Sigma, 美國)。TRAP陽性細(xì)胞被認(rèn)為是破骨細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

RNA制備和逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)

根據(jù)制造商的指示，用試劑盒從破骨細(xì)胞中提取總核糖核酸（Invitrogen, 美國）。在20μL反應(yīng)系統(tǒng)中，一個微觀的RNA通過GoScript逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（Promega, 美國）被反向轉(zhuǎn)錄成第一個鏈cDNA。使用循環(huán)參數(shù)如下:40個周期PF變性，在95度下15秒和60度下熱處理60秒。對每個樣品 進(jìn)行了重復(fù)3次試驗(yàn)。使用熒光試劑混合（試劑盒，德國）在瑞士羅氏480II燈下做定量PCR反應(yīng)。通過比較周期閾值(Ct)方法測定MMP 9, CTSK, NFATc-1和RANKL等破骨細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的Mrna表達(dá)水平，并進(jìn)行規(guī)范化至GAPDH表達(dá)水平。PCR反應(yīng)引物序列見表1。

表1. 引物序列

統(tǒng)計(jì)分析

在目前研究中所有數(shù)據(jù)被報(bào)道是用平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差比較法在兩組間使用非成對或非參數(shù)的Mann-Whitney測試完成的。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析。P<0.05被認(rèn)為是有意義的。

圖1 復(fù)合骨膠原對GIOP小鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響。小鼠被皮下植入60天緩釋7.5mg安慰劑丸或氫化波尼松丸，復(fù)合骨膠原灌胃。

A：從正常組、安慰劑組、氫化波尼松組和復(fù)合骨膠原組用微CT分析下的脛骨近端的三維重建。

B：微ct分析近端脛骨的參數(shù)直方圖：相對骨體積與總體積比（BV/TV）；小梁數(shù)目(Tb.N);小梁的空間(Tb.Sp);連接密度(Conn.D)。

C：在不同組中股骨H&E染色的代表圖像，比例尺為20 μm。數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n=5-7/組。治療組和控制組的差異具有統(tǒng)計(jì)意義，結(jié)果顯示為*P<0.05, **P<0.01。

圖2 復(fù)合骨膠原抑制GIOP小鼠RANKL/OPG比率的表達(dá)。

A .GIOP小鼠中RANKL 和OPG的蛋白免疫印跡分析。

B.柱狀圖顯示氫化波尼松導(dǎo)致了RANKL /OPG信號通路的激活，因此促進(jìn)了糖皮質(zhì)激素引發(fā)的骨質(zhì)疏松（GIOP）。復(fù)合骨膠原減輕骨組織中RANKL /OPG比率，從而保護(hù)小鼠免于GIOP。所有結(jié)果顯示均值± SD, n=3-5/group, *P<0.05。

結(jié)果

在GIOP小鼠體內(nèi)，復(fù)合骨膠原對骨骼微結(jié)構(gòu)的影響

通過顯微CT觀察左脛骨骨微結(jié)構(gòu)。采用3D重建技術(shù)來直接評估骨骼結(jié)構(gòu)和骨密度。通過分析包含BV/TV, Tb.N, Tb.Sp和Conn.D的骨小梁參數(shù)來計(jì)算骨骼微結(jié)構(gòu)。與正常組和安慰劑組對比，在3D重建中氫化波尼松組顯示明顯的骨流失（圖1A）。在測量BV/TV, Tb.N 和 Conn.D.時顯示明顯的下降。復(fù)合骨膠原治療組，BV/TV, Tb.N 和Conn.D.參數(shù)顯著增長，且骨小梁間的間距減少（圖1B）。在脛骨H&E著色中也顯現(xiàn)了同樣的結(jié)果（圖1C）。復(fù)合骨膠原改善了由脫氫皮質(zhì)醇導(dǎo)致的骨小梁流失。同時，以上結(jié)果顯示氫化波尼松降低骨密度（BMD）并使骨小梁微結(jié)構(gòu)稀疏，這從而導(dǎo)致小鼠更容易發(fā)生骨折。通過增加骨小梁和強(qiáng)化骨微結(jié)構(gòu)，復(fù)合骨膠原可以保護(hù)小鼠免于GCs導(dǎo)致的骨流失。

復(fù)合骨膠原影響GIOP小鼠的RANKL/OPG表達(dá)。

為了探究復(fù)合骨膠原對糖皮質(zhì)激素引發(fā)骨質(zhì)疏松的抑制作用的可能的潛在機(jī)理，我們首先檢查了生物化學(xué)標(biāo)記血清鈣（Ca2+）和血清磷酸鹽。與正常組和安慰劑組對比而言，用氫化波尼松球團(tuán)小組顯示出低濃度的血清鈣離子。復(fù)合骨膠原加強(qiáng)了血清鈣離子的濃度。然而，血清磷酸鹽并沒有明顯差異。接下來，我們對脛骨和腿骨中的RANKL和OPG的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行了評估（圖2A），RANKL和它的誘騙受體OPG是調(diào)節(jié)骨吸收和骨形成平衡的2個重要分子。RANKL表達(dá)的增加或是OPG表達(dá)的減少會導(dǎo)致破骨細(xì)胞進(jìn)一步分化和活躍[12,13]。在GIOP小鼠中，非常有趣的是氫化波尼松誘發(fā)了RANKL的嚴(yán)重過表達(dá)，而非OPG的表達(dá)（圖2B）。在復(fù)合骨膠原組中RANKL的增強(qiáng)表達(dá)和OPG的抑制表達(dá)均得到了緩解。

復(fù)合骨膠原抑制了BMMs中破骨細(xì)胞的分化。

接下來將研究BMMs對GCs、復(fù)合骨膠原和骨質(zhì)疏松之間的關(guān)系。地塞米松，復(fù)合骨膠原影響了BMMs的抗毒性（圖3A）。顯著的是從0μM到 1μM地塞米松組劑量依賴破骨細(xì)胞分化（圖3B）。TRAP+細(xì)胞的數(shù)量和區(qū)域隨地塞米松的增加而增加（圖3C）。當(dāng)增加復(fù)合骨膠原時，TRAP+細(xì)胞的數(shù)量和區(qū)域下降且無細(xì)胞毒性（圖3D和3E）。因此，GCs促進(jìn)了破骨細(xì)胞的分化和發(fā)育，但是受復(fù)合骨膠原的影響得到抑制。

圖3  在BMMs中，復(fù)合骨膠原抑制破骨細(xì)胞的分化。

A.對于BMMs可用性上，地塞米松和復(fù)合骨膠原的不同濃度。

B.4天的地塞米松(0, 0.001, 0.01, 0.1,1μM)和RANKL (100 ng/ml)的BMMs的TRAP著色。箭頭表明TRAP+多核破骨細(xì)胞。

C. 每孔中TRAP+細(xì)胞數(shù)量。顯示數(shù)據(jù)的平均值± SD, n=3. 

D. 4天的地塞米松(0.1 μM)，復(fù)合骨膠原(0, 0.0015, 0.0075, 0.015, 0.15, 1.5 g/L)和RANKL (0.1 μM)的BMMs的Trap著色。箭頭顯示TRAP+多核破骨細(xì)胞。

E. 每孔中TRAP+細(xì)胞數(shù)量。顯示數(shù)據(jù)的平均值± SD, n=3 *P<0.05; **P<0.01. 基準(zhǔn)尺: 500 μm.

圖4 復(fù)合骨膠原抑制RANKL誘發(fā)的NF-kB and MAPK通路。BMMs用M-CSF (30 ng/ml)培養(yǎng)，細(xì)胞用地塞米松共同培養(yǎng)，使用或不使用復(fù)合骨膠原培養(yǎng)24小時，之后用RANKL (100 ng/ml) 刺激細(xì)胞 0 分鐘，15 分鐘， 30 分鐘和 60分鐘。用蛋白免疫印跡來測量數(shù)種基因中蛋白質(zhì)水平。

A.在15分鐘時 p65 (p-p65)磷酸化表達(dá)增加，經(jīng)地塞米松刺激后的1小時內(nèi)減少。在復(fù)合骨膠原組中，p-p65總體水平降低。

B.MAPK通路亞科(p-ERK, p-JNK, p-p38)呈現(xiàn)與p65磷酸化表達(dá)相似的趨勢。

復(fù)合骨膠原抑制RANKL誘發(fā)的NF-kB 和 MAPK通路。

考慮到NF-kB通路在RANKL促進(jìn)破骨細(xì)胞分化中扮演著重要的角色，因此，我們下一步調(diào)查復(fù)合骨膠原對RANKL誘發(fā)NF-kB 和 MAPK通路活性的效果。如圖4所示的通路，在15分鐘時，復(fù)合骨膠原抑制了由地塞米松誘發(fā)的磷酸化p65的增長。在MAPK通路中，顯示出了同樣的效果。磷酸化p38的增長證實(shí)，在RANKL存在的ERK 和 JNK的地塞米松組，受復(fù)合骨膠原的抑制影響。

復(fù)合骨膠原抑制了破骨細(xì)胞分化的相關(guān)重要分子的表達(dá)

最終，我們發(fā)現(xiàn)，地塞米松組中NF-kB和MAPK通路有增長。這是由復(fù)合骨膠原抑制的結(jié)果。這個結(jié)果提示我們?nèi)z查它的下游信號分子NFATc-1和c-fos。由蛋白質(zhì)印記和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)分析得出復(fù)合骨膠原顯著的抑制了NFATc-1 和 c-fos的表達(dá)。接下來我們檢查了測到的NFATc-1、靶向的MMP 9 and CTSK。并發(fā)現(xiàn)，復(fù)合骨膠原在他們的表達(dá)中起著抑制的作用。地塞米松激活了下游基因NFATc-1, c-fos, MMP 9和CTSK，結(jié)果促進(jìn)了破骨細(xì)胞分化和骨質(zhì)疏松的發(fā)展。然而，復(fù)合骨膠原通過抑制GCs誘發(fā)的破骨細(xì)胞分化從而抑制了這一效果（圖5）。

討論

在中國復(fù)合骨膠原被認(rèn)為是健康的食品，且它們對提高骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度的作用為大眾熟知。在切除卵巢的小鼠中，復(fù)合骨膠原加強(qiáng)了股骨生物力學(xué)指數(shù)，如最大的負(fù)荷量、抗壓力和彈性模量。然而，它們對于GIOP的作用不詳。本次研究主要專注于復(fù)合骨膠原對GIOP小鼠的作用。已公認(rèn)，GCs的內(nèi)源性和生理劑量調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化并最終抑制破骨細(xì)胞的活性來維持骨形成和骨吸收的平衡。過多的GCs有著相反的作用，它將妨礙骨骼體內(nèi)平衡并導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[15]。因?yàn)楦邉┝康腉Cs治療會導(dǎo)致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，這限制了他們的臨床應(yīng)用。RANKL是一個至關(guān)重要的因子，它調(diào)節(jié)GIOP中破骨細(xì)胞的分化和活性。與受體RANK結(jié)合，RANKL開始補(bǔ)充適當(dāng)?shù)姆肿樱纾篢RAFs, 尤其是 TRAF-6，接著激活下游NF-kB信號通路，從而調(diào)節(jié)NFATc-1和它的靶向基因MMP 9和 CTSK的表達(dá)，這樣就促進(jìn)了破骨細(xì)胞的分化和骨質(zhì)疏松[16]。RANKL或RANKL/OPG比率的表達(dá)的增加改變了骨骼體內(nèi)平衡，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[17, 18]。RANKL的減少減弱了破骨細(xì)胞分化和骨吸收過程。以前的研究表明了RANKL對破骨細(xì)胞分化的抑制作用（OPGFc蛋白、RANKL抑制劑狄諾塞麥），主要是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[12, 19]。在這次研究中，我們證實(shí)，氫化波尼松治療的小鼠RANKL和 RANKL/OPG比例的減少，可能解釋了GIOP中復(fù)合骨膠原的保護(hù)作用。

圖5 復(fù)合骨膠原抑制與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的重要分子的表達(dá)。BMMs在RANKL (100 ng/ml) 和M-CSF(30 ng/ml)中培養(yǎng)。在不同組中加入地塞米松(0.1 μM)或復(fù)合骨膠原(1.5 g/L)，細(xì)胞培養(yǎng)2或4天。幾個基因的mRNA的表達(dá)由RT-PCR量化。蛋白質(zhì)含量由免疫印跡檢測。

A.數(shù)個標(biāo)記轉(zhuǎn)基因水平的RTPCR分析與NF-kB 和 MAPK信號通路相關(guān)聯(lián)。

B.NFATc-1, c-fos,MMP 9, CTSK的蛋白表達(dá)免疫印跡分析。顯示數(shù)據(jù)的平均值± SD, n=3。

C.NFATc-1, c-fos, MMP 9和CTS的定量標(biāo)準(zhǔn)化到GAPDH. *P<0.05。

NFATc-1是鈣調(diào)磷酸酶和Ca2+管控的轉(zhuǎn)錄因子，受RANKL誘發(fā)明顯。在破骨細(xì)胞生成期間，RANKL 與 RANK的結(jié)果導(dǎo)致了NFATc-1通過NF-kB信號通路時的脫磷酸作用。因此，細(xì)胞核移位，加強(qiáng)了破骨細(xì)胞關(guān)聯(lián)基因如MMP 9和CTSK的轉(zhuǎn)錄與翻譯。因此影響了破骨細(xì)胞的分化和骨質(zhì)疏松[20, 21]。MMP 9是一種酶，屬于鋅-金屬蛋白酶家族，涉及ECM降級。在骨組織中，MMP 9由破骨細(xì)胞生成，有著降級和改變骨骼中ECM的能力。因此，參與骨吸收和骨重建生理及病變過程[22, 23]。作為溶酶體的半胱氨酸蛋白酶，主要在破骨細(xì)胞中表達(dá)。CTSK也能夠引誘ECM降級。CTSK不足會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松為特征的致密度成骨不全癥紊亂[24]。

我們證實(shí)復(fù)合骨膠原是通過抑制RANKL/OPG通路保護(hù)小鼠免于GIOP。復(fù)合骨膠原治療組的骨小梁數(shù)量及連接性有提高。我們進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)在RANKL存在的情況下，復(fù)合骨膠原治療BMMs時，磷酸化-65和-38的表達(dá)減少。同時，曾使用復(fù)合骨膠原治療的BMMs中發(fā)現(xiàn)向下調(diào)節(jié)下游分子NFATc-1, c-fos, MMP 9 和CTSK。體內(nèi)OPG表達(dá)的增加和RANKL表達(dá)的減少以及體外NF-kB 與MAPK信號通路的抑制，清晰的表明復(fù)合骨膠原是通過NF-kB和MAPK信號通路使小鼠免于GIOP。RANKL表達(dá)的減少和OPG表達(dá)的增強(qiáng)抑制了NF-kB和MAPK信號通路，因此影響了NFATc-1和c-fos的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致MMP 9 和 CTSK的向下調(diào)節(jié)。結(jié)果是，破骨細(xì)胞分化和ECM降級得到緩解，因此改善了GC誘發(fā)的骨質(zhì)疏松。

在這個研究中，我們證實(shí)了GCs對破骨細(xì)胞分化的重要影響。復(fù)合骨膠原通過NF-kB和 MAPK信號通路抑制GC誘發(fā)的骨質(zhì)疏松。GCs在藥理學(xué)劑量誘發(fā)骨質(zhì)疏松不僅僅是破骨細(xì)胞的結(jié)果，同時也是成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的結(jié)果[25]。過多的GCs抑制成骨細(xì)胞的分化和增值，同時促進(jìn)了成骨細(xì)胞的凋亡[26]。先前的研究顯示抑制成骨細(xì)胞分化和增值與Wnt信號向下調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白和RUNX2轉(zhuǎn)錄因子的減少息息相關(guān)[27]。另一個重要的調(diào)節(jié)者是BMP2，它被證實(shí)在曾接受藥理學(xué)劑量GCs的小鼠中被抑制了。β-連環(huán)蛋白，RUNX2 或BMP2的減少導(dǎo)致造骨新生的減少和MSCs向脂肪細(xì)胞分化[28]。此外，治療劑量的GCs誘發(fā)骨細(xì)胞自我吞噬和凋亡，同時也減小了骨細(xì)胞的生存能力[8, 29]。促凋亡激酶的活化或骨細(xì)胞中的自噬體的產(chǎn)生，細(xì)胞毒性環(huán)境的創(chuàng)造，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和死亡。然而，是否是骨細(xì)胞中的自我吞噬的抑制削弱了GIOP還有待研究[30]。

總而言之，我們的研究清晰的表明復(fù)合骨膠原對糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松具有保護(hù)作用。相關(guān)聯(lián)的機(jī)理是RANKL表達(dá)的減少以及NF-kB和 MAPK通路的抑制有關(guān)。這項(xiàng)研究為臨床環(huán)境減弱GIOP提供了一些理論基礎(chǔ)和潛在療法。然而，還需要進(jìn)一步的研究來評估復(fù)合骨膠原對成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞影響，及進(jìn)一步探索潛在的保護(hù)效果的分子機(jī)制。

感謝

本項(xiàng)工作由中國國家自然科學(xué)基金會（補(bǔ)助金81570669, 81200521, 81570615）和武漢衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會（補(bǔ)助金grants 2016whzqnyxgg02）提供支持。

揭露利益沖突

無

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